Plásmido CRISPR de Activación (h) UFM1: sc-416900-ACT

El UFM1 humano codifica el modificador 1 con pliegue tipo ubiquitina (ubiquitin-fold modifier 1), una proteína similar a la ubiquitina que se conjuga a sustratos mediante la cascada de UFMilación en la que participan UBA5, UFC1 y UFL1. Esta modificación postraduccional regula la proteostasis del retículo endoplásmico, el control de calidad asociado al ribosoma y las respuestas celulares al estrés proteotóxico y oxidativo, con conexiones establecidas con la homeostasis del RE y la función de la vía secretora. La señalización dependiente de UFM1 se ha implicado en fenotipos del neurodesarrollo y hematológicos, y la actividad alterada de la UFMilación se estudia en el contexto de la supervivencia de células cancerosas y la adaptación al estrés. Como modificador central de esta vía, UFM1 constituye un nodo útil para analizar cómo la conjugación de proteínas tipo ubiquitina ajusta el recambio proteico, el control de la traducción y las respuestas al estrés de los orgánulos.

UFM1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de UFM1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

UFM1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus UFM1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional UFM1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de UFM1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo UFM1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de UFM1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía UFM1 en células tumorales con expresión de UFM1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.