TMEM38B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-412461-ACT

TMEM38B codifica il canale cationico intracellulare trimerico A (TRIC-A), una proteina di membrana del reticolo endoplasmatico/sarcoplasmatico (RE/RS) che forma canali per cationi monovalenti e supporta il rilascio di Ca2+ fornendo un flusso di controioni. Stabilizzando il potenziale di membrana del RE/RS durante la segnalazione del calcio dipendente dal recettore IP3 e dal recettore della rianodina, TMEM38B contribuisce all’accoppiamento eccitazione–contrazione, all’omeostasi del calcio intracellulare e a programmi trascrizionali a valle regolati dal calcio. L’alterazione della funzione di TMEM38B è stata collegata allo sviluppo scheletrico e all’integrità del tessuto connettivo, con varianti loss-of-function associate a fenotipi simili all’osteogenesi imperfetta. Queste caratteristiche rendono TMEM38B rilevante per studi meccanicistici sulla gestione del calcio nel RE, sulla biologia della matrice e sulle risposte di segnalazione associate allo stress nelle cellule umane.

TMEM38B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TMEM38B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TMEM38B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TMEM38B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TMEM38B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TMEM38B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TMEM38B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TMEM38B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TMEM38B nelle cellule tumorali con espressione di TMEM38B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.