Plasmide CRISPR d'Activation (h) Sec5: sc-405088-ACT

L’EXOC2 humain code Sec5, une sous-unité essentielle du complexe exocyste octamérique, qui ancre les vésicules de sécrétion à la membrane plasmique afin de soutenir l’exocytose polarisée. Sec5 coordonne le ciblage des vésicules avec le remodelage de l’actine et la signalisation des petites GTPases, contribuant à l’expansion membranaire, à la migration cellulaire, à la cytokinèse et à l’adressage régulé de récepteurs et de transporteurs. Par son rôle dans le trafic dépendant de l’exocyste, EXOC2 influence des voies qui gouvernent la polarité épithéliale et la croissance neuritique, et une altération de la fonction de l’exocyste a été associée à une prolifération dérégulée et à des phénotypes invasifs dans divers contextes pathologiques. Les défauts de trafic liés à Sec5 sont donc pertinents pour des études mécanistiques de la dynamique membranaire, de la compartimentation des signaux et des transitions d’état cellulaire.

Sec5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EXOC2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Sec5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EXOC2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EXOC2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Sec5. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EXOC2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Sec5 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Sec5 dans les cellules tumorales présentant une expression de EXOC2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.