RFX6 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-408496-ACT

RFX6 (regulatory factor X6) è un fattore di trascrizione con dominio winged-helix che coordina programmi di regolazione genica necessari per lo sviluppo del pancreas endocrino e per il mantenimento dell’identità delle isole pancreatiche. Nelle cellule umane, RFX6 contribuisce alle reti trascrizionali che governano la differenziazione delle cellule beta, la funzione secretoria dell’insulina e, più in generale, l’omeostasi del glucosio, attraverso la regolazione di promotori ed enhancer specifici di linea cellulare. Un’alterata attività di RFX6 è stata associata a disturbi endocrini congeniti del pancreas e dell’intestino e a fenotipi correlati al diabete, rendendolo un nodo rilevante per lo studio del destino delle cellule endocrine, delle risposte allo stress e della segnalazione metabolica. In quanto regolatore nucleare, RFX6 viene comunemente studiato mediante profili di espressione e saggi basati sulla cromatina per definire i bersagli a valle e i circuiti trascrizionali interagenti.

RFX6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RFX6 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RFX6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RFX6 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RFX6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RFX6. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RFX6 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RFX6 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RFX6 nelle cellule tumorali con espressione di RFX6 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.