Retinal RX Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403576-ACT

RAX (retinal homeobox) codifica il fattore di trascrizione Retinal RX, un regolatore con homeodominio di tipo paired essenziale per la precoce specificazione del campo oculare e per il mantenimento dei progenitori retinici. Agisce a monte dei programmi di differenziamento dei fotorecettori e della neuroretina coordinando reti regolatorie geniche dello sviluppo e influenzando le decisioni di destino cellulare durante il patterning del neuroectoderma. L’attività di RAX si integra con vie che governano proliferazione e differenziamento nella retina in sviluppo, includendo segnali che affinano la morfogenesi oculare. Un’espressione o una funzione di RAX deregolate sono associate a malformazioni oculari congenite come anoftalmia/microftalmia e a difetti più ampi dello sviluppo retinico, confermandone la rilevanza nella modellizzazione di malattia e nella ricerca di biologia dello sviluppo.

Retinal RX Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RAX senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Retinal RX Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RAX nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RAX, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Retinal RX. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RAX nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Retinal RX nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Retinal RX nelle cellule tumorali con espressione di RAX silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.