RecQL5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406407-ACT

Il gene umano **RECQL5** codifica per l’elicasi RecQ **RecQL5**, un fattore di mantenimento del genoma che regola la replicazione e la trascrizione del DNA per limitare la ricombinazione aberrante. RecQL5 interagisce con l’RNA polimerasi II e partecipa alle vie di risposta al danno al DNA che favoriscono la stabilità delle forcelle di replicazione, la risoluzione di strutture secondarie del DNA e la soppressione di riarrangiamenti genomici associati alla ricombinazione omologa. Preservando l’integrità cromosomica, RECQL5 supporta una corretta progressione del ciclo cellulare e contrasta l’accumulo di mutazioni legate a fenotipi di instabilità genomica. La disregolazione dell’attività di RECQL5 è stata collegata a un aumento della segnalazione di danno al DNA e a un controllo alterato della ricombinazione, rendendolo rilevante per studi sui meccanismi di instabilità del genoma in modelli di malattia.

RecQL5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RECQL5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RecQL5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RECQL5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RECQL5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RecQL5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RECQL5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RecQL5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RecQL5 nelle cellule tumorali con espressione di RECQL5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.