PRK2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-407649-ACT

PKN2 codifica la protein chinasi N2 (PRK2), una chinasi serina/treonina della famiglia AGC che agisce come effettore della segnalazione delle GTPasi della famiglia Rho, coordinando la dinamica del citoscheletro, il turnover delle adesioni focali e la motilità cellulare. L’attività di PRK2 integra segnali provenienti da vie legate ai GPCR e ai fattori di crescita per influenzare il rimodellamento dell’actina, la formazione di fibre di stress e il traffico vescicolare, con effetti a valle su programmi di proliferazione e sopravvivenza. Attraverso questi ruoli, PRK2 è stata implicata in processi rilevanti per l’invasione delle cellule tumorali e il comportamento metastatico, oltre che in una più ampia disregolazione della migrazione e della segnalazione dipendente dall’adesione osservata in diversi contesti patologici. Modulare l’espressione endogena di PKN2 è quindi utile per chiarire la connettività tra la segnalazione associata a Rho/ROCK, l’organizzazione del citoscheletro e gli output trascrizionali.

PRK2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PKN2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PRK2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PKN2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PKN2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PRK2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PKN2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PRK2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PRK2 nelle cellule tumorali con espressione di PKN2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.