POL H Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401794-ACT

POLH codifica la DNA polimerasi eta (Pol η), una polimerasi specializzata della famiglia Y che svolge la sintesi di DNA per translesione, consentendo di aggirare durante la fase S i dimeri di pirimidine ciclobutano indotti dai raggi UV e altri voluminosi addotti del DNA. Estendendo le forcelle di replicazione bloccate, POLH contribuisce a mantenere la stabilità del genoma e si coordina con la risposta al danno al DNA, con la riparazione per escissione di nucleotidi e con le vie di riparazione post-replicativa. Difetti in POLH compromettono la fedeltà dell’aggiramento delle lesioni e aumentano il carico mutazionale, collegando la sua disfunzione a fenotipi di sensibilità ai raggi UV e di predisposizione al cancro, inclusa la variante dello xeroderma pigmentoso. POLH è quindi ampiamente studiato nella biologia dello stress replicativo, nei meccanismi di mutagenesi e nel crosstalk tra vie che governa la scelta della riparazione del DNA.

POL H Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di POLH senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

POL H Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus POLH nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione POLH, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di POL H. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus POLH nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da POL H nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via POL H nelle cellule tumorali con espressione di POLH silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.