Pit-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401671-ACT

Das humane POU1F1 kodiert den hypophysenspezifischen POU-Homeodomänen-Transkriptionsfaktor Pit-1, einen zentralen Regulator der Linienspezifizierung des Vorderlappens der Hypophyse und der endokrinen Genexpression. Pit-1 bindet an konservierte Promotor- und Enhancer-Elemente, um Transkriptionsprogramme zu steuern, die für die Entwicklung von Somatotrophen, Laktotrophen und Thyreotrophen erforderlich sind, und koordiniert dabei mit Koregulatoren und Chromatin-Remodeling-Komplexen, um die Zellidentität zu prägen. Diese Achse integriert hypophysäre Entwicklungssignale und Wege der Hormonsynthese, indem sie zentrale Zielgene wie GH1, PRL und TSHB moduliert. Fehlregulationen oder pathogene Varianten in POU1F1 sind mit Hypophysenhormonmängeln und kongenitalem Hypopituitarismus verbunden, wodurch Pit-1 ein häufig verwendetes Modellsystem zur Untersuchung endokriner Differenzierung und der Kontrolle transkriptioneller Netzwerke darstellt.

Pit-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen POU1F1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Pit-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des POU1F1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der POU1F1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Pit-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native POU1F1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Pit-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Pit-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem POU1F1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.