PHOSPHO1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-433594-ACT

Phospho1 codifica a PHOSPHO1, uma fosfatase enriquecida em tecidos em processo de mineralização que hidrolisa fosfoetanolamina e fosfocolina para gerar fosfato inorgânico, apoiando o início da deposição de hidroxiapatita mediada por vesículas da matriz. Em camundongos, a atividade de PHOSPHO1 integra-se à homeostase do fosfato e a programas de desenvolvimento esquelético, atuando em conjunto com reguladores da mineralização, como a fosfatase alcalina, para modular a função de osteoblastos e condrócitos. A interrupção ou desregulação de PHOSPHO1 está associada a fenótipos de mineralização óssea prejudicada e a alterações na maturação da matriz extracelular, o que a torna relevante para estudos de fragilidade esquelética e de distúrbios ósseos do desenvolvimento. Como um componente-chave da biologia da mineralização, é frequentemente investigada em vias que regulam a osteogênese, a transição de cartilagem para osso e o manejo local de fosfato.

PHOSPHO1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Phospho1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PHOSPHO1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Phospho1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Phospho1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PHOSPHO1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Phospho1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PHOSPHO1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PHOSPHO1 em células tumorais com expressão de Phospho1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.