PCPE-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404359-ACT

PCOLCE codifica a proteína potenciadora 1 da procollagénio C-endopeptidase (PCPE-1), uma glicoproteína secretada da matriz extracelular que potencializa o processamento do procologénio fibrilar por metaloproteinases do tipo BMP1/tolloid, ao aumentar a clivagem do pró-peptídeo C. Por meio desta atividade de cofator, a PCPE-1 apoia a maturação do colagénio, a deposição de matriz e a remodelação tecidular, relacionando-se com a organização da matriz extracelular e a proteostase em tecidos conjuntivos. A função da PCPE-1 cruza-se com vias de biossíntese do colagénio e de renovação da matriz que moldam a arquitetura estromal e a sinalização célula–matriz. A regulação alterada da expressão de PCOLCE e do processamento do colagénio tem sido associada à remodelação fibrótica e a outras patologias caracterizadas por acumulação anómala de matriz extracelular.

PCPE-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PCOLCE sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PCPE-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PCOLCE em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PCOLCE, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PCPE-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PCOLCE nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PCPE-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PCPE-1 em células tumorais com expressão de PCOLCE silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.