PAR4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401142-ACT

PAWR codifica a proteína pró-apoptótica PAR4 (prostate apoptosis response-4), um regulador do destino celular contendo um zíper de leucina que modula redes de transcrição e de resposta ao estresse. A PAR4 participa da apoptose intrínseca e do controle do crescimento ao influenciar a sinalização de NF-κB, as vias de sobrevivência PKC/AKT e programas de morte celular dependentes de caspases, além de desempenhar funções adicionais no estresse do retículo endoplasmático (RE) e na proteostase. Alterações na atividade de PAWR/PAR4 têm sido associadas à desregulação da apoptose, à homeostase epitelial e neuronal e, de modo dependente do contexto, a ligações com a biologia tumoral e processos neurodegenerativos. Essas funções tornam o PAWR um ponto útil para estudar o crosstalk entre vias de sinalização de sobrevivência, regulação transcricional e morte celular programada.

PAR4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PAWR sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PAR4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PAWR em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PAWR, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PAR4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PAWR nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PAR4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PAR4 em células tumorais com expressão de PAWR silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.