p40-phox Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401461-ACT

NCF4 codifica a p40-phox, um componente regulador do complexo da oxidase NADPH (NOX2) de fagócitos, que modula a montagem e a atividade da oxidase em endomembranas e fagossomos. Por meio de interações com p67-phox (NCF2), p47-phox (NCF1) e o citocromo de membrana b558, a p40-phox ajuda a controlar a geração de espécies reativas de oxigênio dependente de estímulo, sustentando a eliminação de microrganismos e a sinalização redox. Essa via se integra a processos da imunidade inata, incluindo fagocitose, sinalização do inflamassoma e respostas de citocinas, nos quais a regulação alterada da oxidase pode perturbar a defesa do hospedeiro e a homeostase inflamatória. A atividade desregulada da NOX2 e a sinalização dependente de p40-phox têm sido associadas a fenótipos de imunodeficiência e inflamação, oferecendo um ponto de entrada mecanístico para estudar a regulação do “burst” oxidativo em células mieloides.

p40-phox O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NCF4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

p40-phox O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NCF4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NCF4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de p40-phox. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NCF4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de p40-phox no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via p40-phox em células tumorais com expressão de NCF4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.