Occludin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-418271-ACT

O OCLN humano codifica a ocludina, um componente integral de membrana das fitas das junções estreitas (tight junctions) que regula a permeabilidade da barreira paracelular e a polaridade das células epiteliais. A ocludina participa da montagem e da remodelação das junções por meio de interações com proteínas de arcabouço ZO e de ligações ao citoesqueleto de actina, integrando sinais das vias de Rho GTPases, PKC e MAPK. Seu estado de fosforilação influencia a estabilidade das junções estreitas, a adesão célula–célula e as respostas a sinais inflamatórios. A expressão ou a localização desregulada de OCLN está associada a defeitos de barreira e contribui para modelos de pesquisa de inflamação intestinal e das vias aéreas, integridade da barreira hematoencefálica e transição epitélio-mesênquima.

Occludin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de OCLN sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Occludin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus OCLN em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição OCLN, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Occludin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus OCLN nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Occludin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Occludin em células tumorais com expressão de OCLN silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.