NOPAR Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-409016-ACT

MED12L codifica NOPAR, uma proteína nuclear ligada ao controlo da transcrição e à regulação de genes dependente da RNA polimerase II por mecanismos associados ao complexo Mediator. Ao influenciar a comunicação entre potenciadores e promotores e o recrutamento de cofatores, a MED12L está em posição de modular programas do estado celular, como proliferação, diferenciação e transcrição responsiva ao stress. A perturbação de componentes do eixo Mediator, incluindo a MED12L, está recorrentemente associada a redes de expressão génica desreguladas observadas em perturbações do desenvolvimento e em diversos cancros, sustentando a sua relevância para estudos mecanísticos da desregulação transcricional. A investigação de MED12L/NOPAR é, portanto, útil para mapear circuitos regulatórios e estabelecer ligações entre genótipo e fenótipo em modelos de células humanas.

NOPAR O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MED12L sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NOPAR O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MED12L em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MED12L, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NOPAR. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MED12L nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NOPAR no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NOPAR em células tumorais com expressão de MED12L silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.