NKLAM Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-409031-ACT

O RNF19B humano codifica a NKLAM, uma ligase E3 de ubiquitina do tipo RING que promove a ubiquitinação de substratos e a regulação dependente do proteassoma de proteínas envolvidas em respostas imunes e ao estresse. A atividade da NKLAM tem sido associada a funções efetoras da imunidade inata, incluindo a modulação de respostas antimicrobianas, da sinalização de citocinas e de programas de ativação celular por meio do controle, mediado por ubiquitina, de componentes de sinalização. Ao moldar a renovação proteica e a amplitude dos sinais, o RNF19B participa de vias que influenciam a inflamação, as interações hospedeiro–patógeno e decisões de destino celular. Assim, a regulação alterada de redes de ubiquitinação envolvendo a NKLAM é relevante para estudos de desregulação imune e mecanismos de doença associados à inflamação.

NKLAM O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RNF19B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NKLAM O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RNF19B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RNF19B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NKLAM. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RNF19B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NKLAM no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NKLAM em células tumorais com expressão de RNF19B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.