N-SMase2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401937-ACT

O SMPD3 humano codifica a esfingomielinase neutra 2 (N-SMase2), uma enzima associada à membrana dependente de Mg2+ que hidrolisa a esfingomielina para gerar ceramida e fosfocolina. Por meio da produção de ceramida, a N-SMase2 ajuda a coordenar a sinalização de esfingolipídios ligada à remodelação de microdomínios de membrana, ao tráfego vesicular e a vias responsivas ao estresse que influenciam apoptose, senescência e sinalização inflamatória. A atividade de SMPD3 se cruza com redes de sinalização metabólicas e induzidas por citocinas e contribui para a regulação da homeostase de células neuronais, ósseas e epiteliais. Um equilíbrio desregulado entre esfingomielina e ceramida envolvendo a N-SMase2 tem sido associado na literatura a processos neurodegenerativos, disfunção metabólica e fenótipos associados a tumores, tornando o SMPD3 um alvo útil para genômica funcional focada em vias.

N-SMase2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SMPD3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

N-SMase2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SMPD3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SMPD3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de N-SMase2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SMPD3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de N-SMase2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via N-SMase2 em células tumorais com expressão de SMPD3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.