LIN-28 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401164-ACT

O gene humano LIN28A codifica a LIN-28, uma proteína de ligação a RNA evolutivamente conservada que regula a expressão gênica pós-transcricional ao modular a estabilidade e a tradução de mRNAs e ao bloquear seletivamente a maturação de microRNAs da família let-7. Por meio do eixo LIN28/let-7, a LIN-28 influencia o timing do desenvolvimento, a manutenção de estados semelhantes aos de células-tronco e a reprogramação metabólica, com efeitos a jusante sobre programas de crescimento e diferenciação. A atividade de LIN28A se cruza com vias de biogênese de miRNAs e redes de sinalização que moldam decisões de destino celular, incluindo contextos ligados à proliferação e à pluripotência. A desregulação do eixo LIN28A/let-7 tem sido associada à biologia tumoral e a estados de diferenciação alterados, tornando-o um alvo útil para estudos mecanísticos de redes oncogênicas e da regulação gênica do desenvolvimento.

LIN-28 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de LIN28A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

LIN-28 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus LIN28A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição LIN28A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de LIN-28. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus LIN28A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de LIN-28 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via LIN-28 em células tumorais com expressão de LIN28A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.