IscU1/2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402325-ACT

L’ISCU umano codifica le proteine scaffold IscU1/2, che coordinano la biogenesi de novo dei cluster ferro–zolfo (Fe–S) nei mitocondri e nel citosol, supportando la maturazione di enzimi dipendenti dai Fe–S coinvolti nella fosforilazione ossidativa, nell’attività del ciclo TCA e nel mantenimento del DNA. Agendo come piattaforma di assemblaggio transitoria per il trasferimento dei cluster alle proteine bersaglio, IscU1/2 collega il metabolismo mitocondriale all’omeostasi redox e alle risposte cellulari allo stress. Alterazioni dell’espressione o dello splicing di ISCU compromettono la funzione degli enzimi Fe–S, con effetti a valle sulla produzione di energia e sulla gestione del ferro, e sono state associate a miopatia mitocondriale e a fenotipi neuromuscolari e metabolici più ampi. Queste caratteristiche rendono ISCU un nodo rilevante per lo studio della proteostasi mitocondriale, del metabolismo del ferro e dell’adattamento metabolico in modelli cellulari umani.

IscU1/2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ISCU senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

IscU1/2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ISCU nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ISCU, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di IscU1/2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ISCU nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da IscU1/2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via IscU1/2 nelle cellule tumorali con espressione di ISCU silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.