IDH3A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404788-ACT

IDH3A kodiert die Alpha-Untereinheit der mitochondrialen Isocitrat-Dehydrogenase 3, eines NAD+-abhängigen Enzyms, das im Tricarbonsäurezyklus (TCA-Zyklus) die oxidative Decarboxylierung von Isocitrat zu α-Ketoglutarat katalysiert. Durch die Regulation der mitochondrialen NADH-Produktion unterstützt IDH3A die oxidative Phosphorylierung, das Redoxgleichgewicht sowie die metabolische Kopplung zwischen Glykolyse und biosynthetischen Signalwegen. Veränderte IDH3A-Aktivität und -Expression wurden mit metabolischer Umprogrammierung, mitochondrialer Dysfunktion und proliferativen Phänotypen in Verbindung gebracht, was IDH3A zu einem relevanten Knotenpunkt für die Untersuchung des Energiestoffwechsels und von Stressantworten macht. IDH3A-assoziierte Signalwege überschneiden sich mit Hypoxie-Signalgebung, der Handhabung reaktiver Sauerstoffspezies und dem Kohlenstofffluss in anaplerotische sowie epigenetische Substrate, die aus α-Ketoglutarat abgeleitet werden.

IDH3A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen IDH3A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

IDH3A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des IDH3A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der IDH3A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen IDH3A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native IDH3A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von IDH3A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des IDH3A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem IDH3A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.