Plásmido CRISPR de Activación (h) H⁺/K⁺ ATPase β: sc-403057-ACT

ATP4B codifica la subunidad β de la ATPasa gástrica H+/K+, una ATPasa tipo P heterodimérica necesaria para el ensamblaje, el direccionamiento a membrana y la estabilidad funcional de la bomba de protones en las células parietales. Al favorecer la secreción de H+ a cambio de K+, ATP4B contribuye a la acidificación gástrica, la homeostasis iónica epitelial y los procesos digestivos dependientes del pH. La regulación de la expresión de ATP4B se entrecruza con vías que controlan la diferenciación epitelial, el tráfico de membrana y la organización de los canalículos secretores. La expresión alterada y el reconocimiento inmunitario de componentes de la ATPasa gástrica H+/K+ se han vinculado con disfunción de la mucosa gástrica y fenotipos de gastritis asociados a autoinmunidad, lo que convierte a ATP4B en un marcador útil y un nodo mecanístico en la investigación de la biología del estómago.

H+/K+ ATPase β El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ATP4B sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

H+/K+ ATPase β El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ATP4B en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ATP4B, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de H+/K+ ATPase β. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ATP4B y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de H+/K+ ATPase β en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía H+/K+ ATPase β en células tumorales con expresión de ATP4B silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.