Plasmide CRISPR d'Activation (h) HPRT: sc-417332-ACT

HPRT1 code l’hypoxanthine‑guanine phosphoribosyltransférase (HPRT), une enzyme clé de la voie de sauvetage des purines qui catalyse la conversion de l’hypoxanthine et de la guanine en IMP et GMP à partir du PRPP. En maintenant l’homéostasie des réserves de nucléotides, HPRT soutient la synthèse de l’ADN/ARN et influence les réponses cellulaires au stress métabolique et aux exigences de réplication. L’activité d’HPRT1 est centrale dans le métabolisme des purines, s’inscrit dans les flux biosynthétiques dépendants du PRPP et est largement utilisée comme locus de marqueur de sélection en génétique des cellules de mammifères. Les variants perte de fonction d’HPRT1 perturbent le recyclage des purines et sont associés à des erreurs innées du métabolisme ainsi qu’à des phénotypes neurocomportementaux, offrant un modèle accessible pour étudier la régulation métabolique et les relations génotype‑phénotype.

HPRT Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de HPRT1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

HPRT Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus HPRT1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription HPRT1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de HPRT. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus HPRT1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de HPRT au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie HPRT dans les cellules tumorales présentant une expression de HPRT1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.