hnRNP I CRISPR Activationプラスミド (m): sc-422470-ACT

マウスPtbp1は、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質I（hnRNP I／PTBP1）をコードしており、これはpre-mRNAの選択的スプライシング、3′末端プロセシング、mRNA安定性、ならびにIRES（内部リボソーム進入部位）依存的翻訳を制御するRNA結合タンパク質である。hnRNP Iは、神経分化、増殖、代謝適応に関連するネットワークにおけるエクソン選択を制御することで、組織特異的な転写産物プログラムを形成し、細胞状態の転換に影響を与える。RNA成熟と翻訳を協調的に制御することを通じて、PTBP1は細胞骨格の再構築やストレス応答性遺伝子発現を司る経路とも連携する。PTBP1活性の破綻は、神経発生関連の表現型や、がんにおける遺伝子発現プログラムの再編に関わるスプライシング景観の変化と関連づけられており、RNAプロセシングの機構研究における有用な標的となっている。

hnRNP I CRISPR活性化プラスミド（m）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性Ptbp1の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

hnRNP I CRISPR 活性化プラスミド (m) は、ヒト細胞株における Ptbp1 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はPtbp1転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性hnRNP Iの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のPtbp1遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるhnRNP I依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびPtbp1発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるhnRNP I経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。