Plásmido CRISPR de Activación (h) HADHA: sc-402803-ACT

HADHA codifica la subunidad alfa de la proteína trifuncional mitocondrial, un complejo multienzimático necesario para la β-oxidación de ácidos grasos de cadena larga. HADHA aporta las actividades enoil-CoA hidratasa y 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa, que sostienen la producción de energía mitocondrial y el catabolismo de lípidos, vinculando el flujo de ácidos grasos con el equilibrio redox y la homeostasis metabólica. La alteración de la función de HADHA se asocia con defectos en la oxidación mitocondrial de ácidos grasos y con estrés celular relacionado con lípidos, por lo que es relevante para estudios de remodelación metabólica y disfunción mitocondrial. Dado que la oxidación de ácidos grasos se cruza con las respuestas al estrés oxidativo y el control de calidad de los orgánulos, HADHA se examina con frecuencia en vías que gobiernan la aptitud mitocondrial y la señalización impulsada por lípidos.

HADHA El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de HADHA sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

HADHA El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus HADHA en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional HADHA, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de HADHA. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo HADHA y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de HADHA en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía HADHA en células tumorales con expresión de HADHA silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.