H-Ras Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400204-ACT

HRAS codifica H-Ras, una piccola GTPasi associata alla membrana che alterna ciclicamente stati legati a GDP e a GTP per trasmettere segnali dai recettori tirosin-chinasici attivati alle vie effettrici a valle. H-Ras attiva le vie di segnalazione RAF–MEK–ERK e PI3K–AKT per regolare proliferazione, differenziamento, dinamica del citoscheletro e sopravvivenza, con ulteriori ruoli nel traffico vescicolare e nella motilità cellulare. Un’attività di HRAS deregolata altera le reti di segnalazione mitogenica ed è implicata nella trasformazione oncogena e nei fenotipi di RASopatia dello sviluppo. In quanto nodo centrale di segnalazione, H-Ras è ampiamente utilizzata per studiare il crosstalk tra vie, il controllo tramite feedback e programmi trascrizionali dipendenti dal contesto.

H-Ras Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HRAS senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

H-Ras Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HRAS nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HRAS, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di H-Ras. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HRAS nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da H-Ras nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via H-Ras nelle cellule tumorali con espressione di HRAS silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.