GRB14 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405224-ACT

GRB14 (proteína 14 ligada ao receptor do fator de crescimento) é uma proteína adaptadora que se liga a tirosina-quinases receptoras ativadas e modula a transdução de sinal a jusante, com interações bem caracterizadas que afetam a sinalização do receptor de insulina e do IGF1R. Ao interagir com complexos de sinalização na membrana plasmática, a GRB14 pode influenciar a atividade das vias PI3K–AKT e MAPK, moldando programas de metabolismo, proliferação e sobrevivência celular. Alterações na expressão ou na atividade de GRB14 têm sido associadas à desregulação da sinalização da insulina e a fenótipos metabólicos, e sua posição na via também a torna relevante para estados celulares dependentes de fatores de crescimento estudados em biologia do câncer. A modulação experimental de GRB14 dá suporte a estudos mecanísticos sobre sinalização proximal ao receptor, controle por feedback e comunicação cruzada entre vias em modelos de células humanas.

GRB14 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GRB14 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GRB14 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GRB14 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GRB14, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GRB14. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GRB14 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GRB14 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GRB14 em células tumorais com expressão de GRB14 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.