GPR41 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402190-ACT

O FFAR3 codifica o receptor acoplado à proteína G GPR41, um sensor de superfície celular para ácidos graxos de cadeia curta, como propionato e butirato, derivados da fermentação microbiana. Após a ligação do ligante, o GPR41 acopla-se principalmente à sinalização Gi/o para reduzir o cAMP e modular vias a jusante que influenciam o metabolismo celular, a homeostase energética e o tônus inflamatório. A atividade de FFAR3/GPR41 tem sido associada à regulação da secreção hormonal e à comunicação neuroimune, posicionando-o na interseção entre a sinalização intestino–microbioma e a fisiologia do hospedeiro. Assim, a sinalização desregulada de FFAR3 é de interesse em estudos sobre disfunção metabólica e mecanismos de doenças inflamatórias, nos quais a detecção de nutrientes mediada por GPCRs se encontra alterada.

GPR41 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FFAR3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GPR41 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FFAR3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FFAR3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GPR41. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FFAR3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GPR41 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GPR41 em células tumorais com expressão de FFAR3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.