GPR4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403659-ACT

O GPR4 humano codifica um receptor acoplado à proteína G sensível a prótons, que funciona como um sensor extracelular de pH, conectando microambientes ácidos à sinalização intracelular. Após a ativação, o GPR4 se acopla a proteínas G heterotriméricas para modular vias de segundos mensageiros, incluindo cAMP/PKA e programas citosqueléticos e transcricionais dependentes de RhoA, influenciando o comportamento de células endoteliais e imunes. Esse receptor contribui para a regulação da homeostase vascular, da função de barreira e da sinalização inflamatória em contextos em que ocorre acidose tecidual. A atividade alterada do GPR4 tem sido associada a processos relevantes para a patologia, como inflamação vascular e respostas ao estresse do microambiente em modelos de câncer e de doenças cardiometabólicas, tornando-o um alvo útil para estudos mecanísticos.

GPR4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GPR4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GPR4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GPR4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GPR4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GPR4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GPR4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GPR4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GPR4 em células tumorais com expressão de GPR4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.