GnT-V Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403921-ACT

O MGAT5 humano codifica a N-acetilglucosaminiltransferase V (GnT-V), uma glicosiltransferase residente no Golgi que catalisa a ramificação β1,6-GlcNAc em N-glicanos. Essa modificação aumenta a complexidade dos glicanos em glicoproteínas de superfície celular e secretadas, influenciando a permanência de receptores na membrana, a responsividade a ligantes e a sinalização a jusante por vias como EGFR/MAPK e PI3K/AKT. Ao remodelar o panorama de glicanos, o MGAT5 contribui para a regulação da adesão célula–célula, da migração e da função de receptores imunes por meio da formação de redes (“lattices”) mediadas por galectinas e de alterações no tráfego intracelular. A atividade desregulada de MGAT5 e a ramificação β1,6 têm sido associadas a mudanças na invasividade de células tumorais, em fenótipos metastáticos e na modulação imune, tornando-o um alvo frequente em estudos de glicobiologia do câncer e de sinalização no microambiente tumoral.

GnT-V O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MGAT5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GnT-V O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MGAT5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MGAT5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GnT-V. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MGAT5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GnT-V no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GnT-V em células tumorais com expressão de MGAT5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.