GHS-R1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401724-ACT

GHSR codifica il recettore del secretagogo dell’ormone della crescita GHS-R1, un GPCR di classe A responsivo alla grelina che regola la segnalazione endocrina e neurometabolica. In seguito al legame con il ligando, GHS-R1 si accoppia principalmente a Gq/11 per stimolare la fosfolipasi C, il turnover dei fosfati dell’inositolo, la mobilizzazione del Ca2+ intracellulare e le vie a valle associate a MAPK/ERK e PI3K, con ulteriore crosstalk mediato dallo scaffolding di β-arrestina. Questo recettore integra il sensing dei nutrienti con l’attività dell’asse ipotalamo–ipofisario, influenzando la regolazione dell’appetito, il rilascio dell’ormone della crescita e l’omeostasi energetica. Alterazioni dell’espressione o della segnalazione di GHSR sono state implicate in caratteristiche associate all’obesità, nella disregolazione metabolica e in fenotipi endocrini, supportandone l’impiego come bersaglio meccanicistico in farmacologia dei recettori e in studi delle reti di segnalazione.

GHS-R1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GHSR senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GHS-R1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GHSR nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GHSR, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GHS-R1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GHSR nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GHS-R1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GHS-R1 nelle cellule tumorali con espressione di GHSR silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.