GCKR Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401623-ACT

O GCKR humano codifica a proteína reguladora da glucocinase, um modulador do aproveitamento de glicose enriquecido em hepatócitos que se liga à glucocinase e a sequestra para ajustar o fluxo glicolítico em resposta ao estado nutricional e ao fosfato. Ao regular a disponibilidade de glucocinase, o GCKR influencia o sensoriamento hepático de glicose, a síntese de glicogênio e o equilíbrio entre a glicólise e a lipogênese de novo, integrando o metabolismo de carboidratos à produção de triglicerídeos. Variações genéticas ou alterações na expressão de GCKR têm sido associadas a mudanças na glicemia de jejum, na sensibilidade à insulina e em características lipídicas circulantes, tornando-o relevante para a biologia das doenças metabólicas. Em modelos baseados em células, perturbar o GCKR oferece uma maneira prática de investigar a organização das vias metabólicas hepáticas e programas transcricionais responsivos a nutrientes.

GCKR O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GCKR sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GCKR O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GCKR em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GCKR, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GCKR. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GCKR nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GCKR no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GCKR em células tumorais com expressão de GCKR silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.