frizzled-3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403362-ACT

FZD3 codifica a frizzled-3, um receptor de Wnt com sete domínios transmembrana que converte sinais extracelulares de Wnt em programas de sinalização intracelular que regulam a polaridade, a migração e a diferenciação celular. Como componente central das vias de Wnt, a frizzled-3 pode influenciar tanto a transcrição dependente de β-catenina quanto a sinalização não canônica de polaridade celular planar e a sinalização associada ao cálcio, dependendo do ligante e do contexto celular. A atividade de FZD3 está intimamente ligada a processos do neurodesenvolvimento, como o direcionamento axonal e a organização sináptica, e a desregulação da sinalização Wnt–FZD tem sido associada à proliferação aberrante e a fenótipos invasivos em modelos relevantes para câncer. Essas propriedades tornam a frizzled-3 um ponto útil para investigar a arquitetura da rede de Wnt, a especificidade receptor–ligante e a comunicação cruzada entre vias em células humanas.

frizzled-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FZD3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

frizzled-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FZD3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FZD3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de frizzled-3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FZD3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de frizzled-3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via frizzled-3 em células tumorais com expressão de FZD3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.