Fibulin-3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401978-ACT

EFEMP1 codifica la fibulina-3, una glicoproteina secreta della matrice extracellulare che si associa alle fibre elastiche e ai componenti della membrana basale per regolare l’organizzazione della matrice, l’adesione cellula–matrice e il rimodellamento tissutale. La fibulina-3 influenza reti di segnalazione legate all’omeostasi della matrice extracellulare, inclusa la modulazione dell’attività delle proteasi e il crosstalk con vie come TGF-β e VEGF, che modellano angiogenesi, fibrosi e risposte allo stress. Un’alterata espressione di EFEMP1 è stata riportata in contesti che coinvolgono l’integrità retinica e la degenerazione maculare, così come nel rimodellamento dello stroma associato ai tumori, a supporto della sua rilevanza per studi sulla regolazione del microambiente. Queste caratteristiche rendono EFEMP1 un bersaglio utile per indagare la dinamica della matrice extracellulare, le interazioni epitelio–mesenchimali e la proteostasi associata alla secrezione.

Fibulin-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EFEMP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Fibulin-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EFEMP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EFEMP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Fibulin-3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EFEMP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Fibulin-3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Fibulin-3 nelle cellule tumorali con espressione di EFEMP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.