Fibulin-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401754-ACT

FBLN1 codifica la fibulina-1, una glicoproteina secreta della matrice extracellulare che si associa alle fibre elastiche e ai componenti della membrana basale per regolare l’assemblaggio della matrice, l’adesione cellulare e il rimodellamento tissutale. La fibulina-1 interagisce con le integrine e con altre proteine della ECM influenzando l’organizzazione del citoscheletro, la migrazione cellulare e la disponibilità di fattori di crescita, collegandola alla segnalazione matrice extracellulare–recettore e alla meccanotrasduzione. Un’espressione alterata di FBLN1 e un deposito anomalo di fibulina-1 sono stati osservati in contesti di rimodellamento vascolare, fibrosi e cambiamenti dello stroma associati ai tumori, rendendola rilevante per studi sui fenotipi guidati dal microambiente. Nei modelli cellulari umani, FBLN1 viene spesso studiato per il suo contributo alle interazioni epitelio–mesenchima, alla funzione endoteliale e alla regolazione, dipendente dalla matrice, di proliferazione e motilità.

Fibulin-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FBLN1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Fibulin-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FBLN1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FBLN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Fibulin-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FBLN1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Fibulin-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Fibulin-1 nelle cellule tumorali con espressione di FBLN1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.