fibrillin-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401449-ACT

FBN1 codifica a fibrilina-1, uma grande glicoproteína da matriz extracelular que se organiza em microfibrilas, fornecendo suporte estrutural e elasticidade aos tecidos conjuntivos. A fibrilina-1 serve de arcabouço para a formação de fibras elásticas e regula a biodisponibilidade de fatores de crescimento — em particular as vias de sinalização de TGF-β e BMP — ao sequestrar complexos latentes na matriz. Por meio dessas funções, influencia a mecanotransdução, as interações célula–matriz e a homeostase tecidual no sistema vascular, pulmões, pele e sistema musculoesquelético. Alterações na expressão de FBN1 ou na integridade das microfibrilas estão associadas a doenças hereditárias do tecido conjuntivo e a uma atividade desregulada da via de TGF-β, relevante para fenótipos cardiovasculares e esqueléticos.

fibrillin-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FBN1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

fibrillin-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FBN1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FBN1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de fibrillin-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FBN1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de fibrillin-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via fibrillin-1 em células tumorais com expressão de FBN1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.