FAT4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405268-ACT

O FAT4 humano codifica uma caderina atípica que se localiza nas junções célula–célula e contribui para a polaridade planar das células, a morfogênese tecidual e o controle do crescimento dependente de contato. O FAT4 atua na rede de sinalização Hippo ao influenciar a atividade das quinases centrais e os outputs transcricionais a jusante que regulam proliferação, apoptose e organização epitelial. Por meio de funções na coordenação do citoesqueleto e no estabelecimento de polaridade, o FAT4 impacta o padronamento do desenvolvimento e a manutenção da arquitetura dos tecidos. A desregulação ou perda de FAT4 tem sido associada a programas de polaridade alterados e a fenótipos relevantes para tumores, tornando-o um alvo útil para estudos mecanísticos do controle do crescimento e da integridade epitelial.

FAT4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FAT4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

FAT4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FAT4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FAT4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de FAT4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FAT4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de FAT4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via FAT4 em células tumorais com expressão de FAT4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.