FAM20C Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-406736-ACT

FAM20C codifica uma quinase secretada localizada no aparelho de Golgi que fosforila motivos Ser-x-Glu/pSer em numerosas proteínas extracelulares e secretadas, incluindo membros da família SIBLING e outros fatores associados à matriz. Por meio da regulação da fosforilação de proteínas na via secretora, a FAM20C influencia a organização da matriz extracelular, a biomineralização e a sinalização célula–matriz, com efeitos a jusante sobre a diferenciação osteogênica e a homeostase tecidual. Alterações na atividade da FAM20C e fosfoproteomas secretados desregulados têm sido associadas a defeitos no desenvolvimento esquelético e dentário e a fenótipos mais amplos do tecido conjuntivo, tornando-a um nó central para o estudo da biologia da matriz. Seu papel na modificação pós-traducional dependente do Golgi também conecta a FAM20C a vias que controlam a secreção, o controle de qualidade proteica e a sinalização intercelular por meio do meio extracelular.

FAM20C O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FAM20C sem alterar a sequência de ADN subjacente.

FAM20C O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FAM20C em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FAM20C, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de FAM20C. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FAM20C nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de FAM20C no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via FAM20C em células tumorais com expressão de FAM20C silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.