Plasmide CRISPR d'Activation (h) Espin: sc-403106-ACT

L’ESPN humain code l’espin, une protéine de faisceautage de l’actine qui régule l’assemblage et la stabilité de faisceaux parallèles de filaments d’actine dans les microvillosités et les stéréocils. L’espin soutient la morphogenèse de protrusions spécialisées, l’architecture mécanosensorielle et le remodelage du cytosquelette en coordonnant la dynamique de l’actine et l’échafaudage associé à la membrane. Par son influence sur l’organisation des stéréocils, ESPN est liée à la fonction des cellules ciliées sensorielles et est étudiée dans des voies gouvernant la spécialisation de la surface épithéliale et la mécanotransduction. Une dérégulation ou une altération génétique d’ESPN a été associée à des déficits auditifs héréditaires et à des anomalies connexes de la structure des stéréocils, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude des mécanismes des maladies du cytosquelette.

Espin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ESPN sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Espin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ESPN dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ESPN, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Espin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ESPN natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Espin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Espin dans les cellules tumorales présentant une expression de ESPN silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.