ESE-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403728-ACT

ELF3 codifica ESE-1, un fattore di trascrizione della famiglia ETS con espressione ristretta all’epitelio, che regola l’espressione genica specifica di linea e i programmi di differenziamento nei tessuti di barriera. ESE-1 integra segnali provenienti da vie infiammatorie e sensibili allo stress per modulare reti trascrizionali che controllano la polarità cellulare, l’organizzazione delle giunzioni e la proliferazione, con interazioni riportate con i circuiti regolatori associati a MAPK/ERK e NF-κB. Un’attività disfunzionale di ELF3 è stata associata ad alterazioni dell’omeostasi epiteliale e a cambiamenti negli stati trascrizionali associati ai tumori, rendendolo rilevante per studi sul riprogramming oncogenico, su fenotipi legati all’invasione e sulle interazioni epitelio–immunitarie. In quanto regolatore che si lega al DNA, ESE-1 rappresenta un nodo maneggevole per analizzare la logica di promotori/enhancer e output trascrizionali dipendenti dal contesto in modelli cellulari umani.

ESE-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ELF3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ESE-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ELF3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ELF3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ESE-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ELF3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ESE-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ESE-1 nelle cellule tumorali con espressione di ELF3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.