EMP-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-420165-ACT

O gene Emp1 de camundongo codifica a proteína 1 de membrana epitelial (EMP-1), uma proteína tetraspan associada à membrana implicada na regulação da adesão célula–célula, da diferenciação epitelial e de sinalização relacionada à função de barreira. A EMP-1 tem sido associada à modulação da sinalização de receptores e da organização do citoesqueleto, que influenciam proliferação, migração e respostas ao estresse, com funções dependentes do contexto na homeostase dos tecidos. Padrões alterados de expressão de EMP1 foram relatados em contextos inflamatórios e fibróticos e em múltiplos fenótipos associados ao câncer, nos quais podem correlacionar-se com mudanças na invasividade e na plasticidade celular. Essas características tornam o Emp1 um nó útil para estudar programas de sinalização próximos à membrana que acoplam sinais extracelulares a desfechos transcricionais e fenotípicos.

EMP-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Emp1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

EMP-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Emp1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Emp1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de EMP-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Emp1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de EMP-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via EMP-1 em células tumorais com expressão de Emp1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.