copine 8 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-426239-ACT

Maus-Cpne8 kodiert Copine 8, ein calciumabhängiges phospholipidbindendes Protein mit C2-Domänen und einer A-Domäne, die eine regulierte Membranassoziation unterstützt. Mitglieder der Copine-Familie werden mit calciumgetriggerten Signalereignissen an der Plasmamembran und in endomembranären Kompartimenten in Verbindung gebracht und beeinflussen den vesikulären Transport, Membranumbauprozesse sowie die Dynamik der Rekrutierung von Proteinen. Durch die Kopplung von Ca2+-Flüssen an membrannahe Proteininteraktionen ist Copine 8 für Signalwege relevant, die den Rezeptorumsatz und die Stärke intrazellulärer Signalübertragung mitbestimmen. Eine veränderte Regulation von Calcium- und Membrantransport-Netzwerken wird häufig in Kontexten wie neuronaler Kommunikation, Immun-Signalgebung und Stressantworten untersucht, wodurch Cpne8 ein nützliches Ziel für die mechanistische Analyse von Signalwegen ist.

copine 8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Cpne8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

copine 8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Cpne8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Cpne8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen copine 8-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Cpne8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von copine 8-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des copine 8-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Cpne8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.