CD154 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401682-ACT

CD40LG codifica o CD154 (ligante de CD40), uma proteína transmembranar do tipo II exibida transitoriamente em células T CD4+ ativadas e em outros subconjuntos imunes, que fornece sinais coestimuladores essenciais a células B, células dendríticas e macrófagos que expressam CD40. A interação CD154–CD40 promove a formação de centros germinativos, a recombinação de troca de classe das imunoglobulinas e o “licenciamento” de células dendríticas, integrando a apresentação de antígeno com a polarização adaptativa da resposta imune. A sinalização a jusante envolve a ativação dependente de TRAF das vias NF-κB, MAPK e PI3K, que regulam a produção de citocinas, a sobrevivência e a diferenciação celular. A atividade desregulada de CD40LG/CD154 está associada a alterações da imunidade humoral e a fenótipos imunes inflamatórios, reforçando sua relevância em estudos de regulação imune e de mecanismos relacionados à autoimunidade.

CD154 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CD40LG sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CD154 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CD40LG em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CD40LG, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CD154. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CD40LG nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CD154 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CD154 em células tumorais com expressão de CD40LG silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.