CCDC69 Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-424629-LAC

Nel topo, Ccdc69 codifica CCDC69, una proteina contenente un dominio coiled-coil implicata nell’organizzazione del citoscheletro e nella progressione mitotica, con collegamenti riportati a processi associati al centrosoma e al fuso che contribuiscono a mantenere la stabilità del genoma. Le proteine di impalcatura coiled-coil spesso coordinano l’assemblaggio di complessi multiproteici che regolano la dinamica dei microtubuli, la segnalazione dei checkpoint e il rimodellamento dipendente dal ciclo cellulare. Un’alterata regolazione di queste vie può influenzare proliferazione, aneuploidia e risposte allo stress, rendendo Ccdc69 di interesse per lo studio dei meccanismi che collegano la fedeltà della divisione alla più ampia omeostasi cellulare. Nei sistemi modello murini, la modulazione dell’espressione di Ccdc69 consente di investigare gli effetti a livello di pathway sul controllo del ciclo cellulare e su fenotipi rilevanti per la malattia, senza implicare esiti clinici.

Le particelle di attivazione lentivirale CCDC69 (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Ccdc69 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale CCDC69 (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Ccdc69, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di CCDC69. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Ccdc69 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.