Plasmide CRISPR d'Activation (m) cathepsin D: sc-419875-ACT

Le gène murin **Ctsd** code la cathepsine D, une endopeptidase aspartique lysosomale essentielle au renouvellement intracellulaire des protéines et au maintien de la fonction lysosomale–autophagie. La cathepsine D participe à la protéolyse endolysosomale, au traitement des antigènes et à des voies de contrôle qualité qui influencent le métabolisme cellulaire et les réponses au stress. Une activité dérégulée de la cathepsine D a été associée à des altérations de la protéostase, à une atteinte lysosomale liée à la neurodégénérescence et à la biologie tumorale, via des effets sur l’apoptose et le remodelage de la matrice extracellulaire. En tant qu’enzyme marqueur lysosomal largement utilisée, la cathepsine D soutient les études mécanistiques du trafic vésiculaire, du flux autophagique et de la signalisation dépendante des protéases dans des modèles murins.

cathepsin D Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Ctsd sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

cathepsin D Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Ctsd dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Ctsd, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de cathepsin D. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Ctsd natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de cathepsin D au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie cathepsin D dans les cellules tumorales présentant une expression de Ctsd silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.