CAR CRISPR Activation Plasmid (h): sc-418548-ACT

CXADR kodiert den Coxsackievirus- und Adenovirus-Rezeptor (CAR), ein Adhäsionsmolekül der Immunglobulin-Superfamilie, das besonders an Tight Junctions angereichert ist und dort zur Organisation der epithelialen Barriere sowie zu interzellulären Kontakten beiträgt. CAR ist an der Bildung von Zell-Zell-Kontakten und an Signalprozessen beteiligt, die mit dem Umbau des Zytoskeletts und der Zellpolarität verknüpft sind, und beeinflusst dadurch die Zell-Zell-Kommunikation und die Gewebearchitektur. Veränderte CXADR-Expression und -Lokalisation wurden mit Veränderungen der epithelialen Integrität, Entwicklungsprogrammen und tumorassoziierten Phänotypen wie dysregulierter Adhäsion und Invasivität in Verbindung gebracht. Als viraler Andockfaktor ist CAR zudem für Studien zu Wirt–Pathogen-Interaktionen und Mechanismen des Viruseintritts in menschliche Zellen relevant.

CAR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CXADR-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CAR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CXADR-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CXADR-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CAR-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CXADR-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CAR-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CAR-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CXADR-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.