CaMKV Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404961-ACT

CAMKV codifica a CaMKV (quinase proteica do tipo Ca2+/calmodulina-dependente), um membro atípico da família CaMK implicado na sinalização neuronal e na regulação da expressão gênica dependente da atividade. A CaMKV tem sido associada a processos responsivos a cálcio/calmodulina que influenciam a plasticidade sináptica, o desenvolvimento de neuritos e a dinâmica do citoesqueleto, integrando o influxo de cálcio a montante com programas transcricionais a jusante. A desregulação da expressão ou da sinalização de CAMKV tem sido associada a fenótipos do neurodesenvolvimento e neuropsiquiátricos, o que a torna relevante para o estudo de mecanismos moleculares que moldam a conectividade e a excitabilidade neuronais. Assim, o CAMKV humano é um alvo útil para dissecar vias dependentes de cálcio em modelos neuronais e sistemas celulares relacionados.

CaMKV O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CAMKV sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CaMKV O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CAMKV em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CAMKV, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CaMKV. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CAMKV nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CaMKV no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CaMKV em células tumorais com expressão de CAMKV silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.