BRP44L Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404976-ACT

O MPC1 humano codifica a subunidade BRP44L do transportador mitocondrial de piruvato, um complexo-chave da membrana interna que importa piruvato para a matriz mitocondrial para alimentar o ciclo do TCA (ciclo do ácido tricarboxílico) e a fosforilação oxidativa. Ao regular o equilíbrio entre a respiração mitocondrial e a glicólise citosólica, o MPC1 influencia a anaplerose, a homeostase redox e o fluxo de carbono para vias biossintéticas. Alterações na atividade de MPC1/BRP44L têm sido associadas à reprogramação metabólica observada em estados proliferativos e a fenótipos de disfunção mitocondrial em diversos sistemas modelo. Como resultado, o MPC1 é comumente estudado em contextos que envolvem metabolismo energético, sinalização mitocondrial e vias de detecção de nutrientes.

BRP44L O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MPC1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

BRP44L O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MPC1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MPC1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de BRP44L. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MPC1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de BRP44L no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via BRP44L em células tumorais com expressão de MPC1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.