B7-1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-419570-ACT

Das murine Cd80 kodiert den kostimulatorischen Liganden B7-1 (CD80), einen zentralen Regulator der adaptiven Immunität, der auf antigenpräsentierenden Zellen wie dendritischen Zellen, Makrophagen und aktivierten B-Zellen exprimiert wird. B7-1 bindet an CD28 und fördert dadurch das Priming von T-Zellen, die Zytokinproduktion und die klonale Expansion; zudem bindet es an CTLA-4, um Aktivierungsschwellen zu modulieren und die Immunhomöostase aufrechtzuerhalten. Über diese Rezeptorinteraktionen beeinflusst Cd80 die Bildung der immunologischen Synapse, antigengetriebene Signalprogramme sowie das Gleichgewicht zwischen Effektor- und regulatorischen T-Zellantworten. Eine dysregulierte CD80-Expression wurde mit veränderter Immunaktivierung bei Entzündung und Autoimmunität in Verbindung gebracht und kann in murinen Krankheitsmodellen auch das antitumorale Immunmikromilieu prägen.

B7-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Cd80-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

B7-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Cd80-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Cd80-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen B7-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Cd80-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von B7-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des B7-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Cd80-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.