Aquaporin 2/AQP2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400402-ACT

A aquaporina 2 (AQP2) é um canal de água regulado pela vasopressina, expresso predominantemente nas células principais do ducto coletor renal, onde controla a permeabilidade transepitelial à água e a homeostase hídrica sistêmica. O tráfego da AQP2 para a membrana apical é governado pela sinalização AVPR2–cAMP–PKA e por interações dependentes de fosforilação que modulam a reciclagem de vesículas, a inserção na membrana e a endocitose. Ao acoplar o transporte osmótico de água à polaridade epitelial e à função das junções estreitas, a AQP2 contribui para os mecanismos de concentração renal e para a adaptação ao estado de hidratação. A desregulação da expressão, da fosforilação ou do tráfego da AQP2 está associada a fenótipos de prejuízo na concentração urinária, incluindo diabetes insípido nefrogênico e distúrbios do equilíbrio hídrico ligados à disfunção do ducto coletor.

Aquaporin 2/AQP2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de AQP2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Aquaporin 2/AQP2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus AQP2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição AQP2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Aquaporin 2/AQP2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus AQP2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Aquaporin 2/AQP2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Aquaporin 2/AQP2 em células tumorais com expressão de AQP2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.