Plásmido CRISPR de Activación (h) AKR1D1: sc-404897-ACT

AKR1D1 codifica la esteroide 5β-reductasa, una aldo-ceto reductasa que cataliza un paso esencial en la biosíntesis de ácidos biliares al convertir esteroides Δ4-3-ceto en intermediarios 5β-reducidos. Esta actividad favorece el catabolismo hepático del colesterol, la homeostasis de los ácidos biliares y la señalización metabólica posterior a través de receptores nucleares sensibles a los ácidos biliares, como FXR, vinculando a AKR1D1 con vías más amplias de regulación de lípidos y glucosa. La alteración de la expresión o la función de AKR1D1 puede perturbar la composición de los ácidos biliares y el metabolismo de los esteroides, con relevancia para fenotipos colestásicos y disfunción metabólica hepática. Como enzima enriquecida en hígado, AKR1D1 se estudia con frecuencia en modelos de hepatocitos para definir cómo el flujo de ácidos biliares y el aclaramiento de esteroides influyen en las respuestas al estrés inflamatorio y metabólico.

AKR1D1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de AKR1D1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

AKR1D1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus AKR1D1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional AKR1D1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de AKR1D1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo AKR1D1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de AKR1D1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía AKR1D1 en células tumorales con expresión de AKR1D1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.